柱色層法與紙色層法和薄層色層法的原理相同，但柱色層法主要用於分離複雜的混合物。
在柱色層法中，固定相 (亦稱為吸附劑) 是垂直玻璃柱內的氧化鋁或矽膠，流動相 (亦稱為洗提劑) 則是從柱頂注入，從柱底流出的液體溶劑。
在柱色層法中，選擇合適的洗提劑十分重要，這會直接影響分離的效果。對洗提劑的一般要求包括：純淨和乾燥；對樣本有較大的溶解度；不會與樣本或吸附劑發生反應；極性小於樣本；容易與樣本中的各組分分開。
在利用柱色層法分離混合物時，其主要步驟如下：
準備色層柱。
以適當的溶劑溶解混合物，用滴管將其柱壁均勻地填入柱頂的吸附劑上。
將作為流動相的液體溶劑從柱頂注入，用試管在柱底收集流出物，直至所有的層帶均流出柱外。
隨著溶劑向下流動，混合物中的各成份因極性和吸附能力的不同而逐漸分開。一般而言，極性愈強的成份，與吸附劑之間的作用力愈強，向下移動的速率愈慢。