孟德爾提出的雙基因雜交遺傳規律，最關鍵的假設，是非等位基因在配子形成時是自由組合的。要證明這一點，單憑 (上一節提及) 第二子代的表達型推論，未算完整，是需要進行測交實驗。如能獨立地證明雜合的第一子代配子包括了 4 種基因型，這會是非等位基因自由組合的強力證據。

因此，測交的設計要以揭示第一子代配子的基因型為目的。測交品系的基因型，需要是被測基因座 (Y 和 R) 的隱性純合子，即是 yyrr 。測交的遺傳圖如下：

在以上的測交設計，測交後代的表達型直接反映了第一子代配子的基因型。孟德爾進行了這項測交，實驗結果跟預期一樣，四種測交後代比例平均，支持假說。

獨立分配定律的另一重要驗證，是確立它的本質和分子機制。分子遺傳學一個重要發現，是 DNA 長分子成若干段，每段能獨立地被分配進配子。這些 DNA 分段，就是染色體。染色體獨立分配進配子，是獨立分配定律的基礎。

配子是從母細數細胞分裂製成。在分裂過程中，同源染色體會配對排列在細胞的赤道位置，由細胞紡錘絲分別拉向細胞兩極，配子就從母細胞分配到一半等位基因。

由於紡錘絲捕獲染色體的過程是隨機的，因此 2 條同源染色體被分配進某配子的機會均等。多條非同源染色體的配搭，就能造成大量組合。

對獨立分配定律的認識，可以應用在改良品種上，例如奶牛。

奶牛的生長和產奶量是兩個不同的性狀，可以假設是由不同的基因控制。根據獨立分配定律，這兩種奶牛的雜交後代中，兩個基因自由組合，有可能出現生長既快、產奶亦多的新品種。

雜交的第一子代基因型是雜合，因此第二子代的個體有不同基因型，從畜牧角度看，品質不穩定。透過不斷地雜交、選種、再雜交，新品種的繁殖機會被人工地增加，直至相關基因座都變成純合，後代就能保持穩定的品質了。類似的育種技術，廣泛應用在畜牧業和種植業。

對於雙基因遺傳基因型的概率問題，我們可以使用龐式表進行分析。除此之外，還可以藉助數學中的乘法原理，簡化計算。

乘法原理的基本內容是：兩個獨立事件同時出現的機會率 = 事件1 單獨出現的機會率 x 事件2 單獨出現的機會率

根據孟德爾的發現，兩個不同基因的遺傳是彼此獨立的，即“兩個獨立事件”，所以乘法原理適用。下面有幾個基於第二子代的概率計算的例子

事實上，獨立分配定律不僅適用於雙基因，也適用於多基因的遺傳（當多基因位於非同源染色體）。你看，即使是同一胎所生的小狗，由於不同基因獨立分配、自由組合的緣故，牠們的樣子各有不同。基因重組是造成生物多樣性的一個重要原因。

孟德爾從單一基因入手，先簡單再複雜，一步步發現遺傳的基本規律，這種科學的探索方法非常值得我們學習。