孟德爾為雜交實驗得出的數據作出了一個具說服力的解釋，但這不是一個完整的證明。任何科學假說必須能提供一定數量的預測，而且這些預測可用觀察或實驗驗證。經過驗證的假說有高的可信度，而通過的驗證越多，可信度越高。

孟德爾的遺傳論其中一個重點是：生物個體的 2 個等位基因會在繁殖時分離，分配入不同的配子中。遺傳論要成立，就必須要證明這個分離現象的存在。

遺傳物質的化學本質(DNA)要到 1940 年代才被發現，而有關的化學分子機制更在 1960 年代才被確立。究竟孟德爾在 1860 年代如何驗證他的假說呢？

如果一對等位基因能夠分離，那麼從雜種個體產生的配子會有 2 種（右圖的 T/t）。這些配子與只帶有隱性等位基因的配子結合時，親代個體內等位基因的遺傳性狀，就能個別在子代顯現（性狀分離）。最重要的是它們應該有相同的數量比例。

在孟德爾的雜交測試（測交）中，只提供隱性等位基因配子的豌豆品系被稱為測交品系。測交品系通常都是純種品系，等位基因都已被確認為隱性。

表現顯性性狀生物可能擁有純合或雜合的基因型，我們可以進行測交來確定該生物的基因型。進行測交時，應把未知基因型的生物與具有隱性性狀的純合同種生物雜交。

以上的假說，可歸納為：

1. 生物特徵以遺傳單位傳遞；（現代稱這些單位為基因。）

2. 基因成對，以等位基因的形式存在於生物個體；（大部份生物的基因都有 2 份，但也有例外；人體中也有部份細胞只有 1 份基因）

3. 配子形成時，每對等位基因分離，使每個配子只分配到其中一個等位基因；

4. 每個配子只分配到 1 個等位基因。

以上的第 3、4 點，被稱為孟德爾第一定律，又名分離定律。

分離定律的核心就是「分離」。從現象上看，是後代性狀的分離；從本質上看，是等位基因發生了分離，產生了不同的配子，把不同的遺傳資料傳遞到下一代。

在孟德爾的時代（1822-1884），人們並不瞭解基因的化學本質，只是通過生物表現出來的性狀（或特徵）來推測生物的遺傳成份。

一個生物個體的性狀表達形態（即可觀察的特徵）稱為表達型，而個體中某特徵的等位基因內容（即遺傳組合），則稱為基因型。

一種基因型通常只有一種相應的表達型，但一種表達型卻常有多於一種可能的基因型，例如高豌豆這種表達型，基因型可以是 TT 或是 Tt。

遺傳學研究的其中一個重點，就是分析個體的表達型（特別是新奇的現象），從而推測其可能的基因型，然後設計實驗去驗證。

孟德爾的遺傳論能準確地預測生物的表達型和性狀表現規律，但礙於技術條件，他只能用抽象的概念（例如：遺傳單位）來描述遺傳規律，卻無法闡明這些抽象概念的實體本質（例如：遺傳單位究竟是甚麼？有甚麼化學特性？）。

直至 1960 年代，即孟德爾逝世 70 年後，遺傳物質的化學結構和反應機制被確立，才徹底證實孟德爾的遺傳論。

遺傳物質（基因）的本質是核苷酸長鏈聚合物 (DNA) 的片段。生物有許多基因（由細菌的約一千個，到人類的約二萬個），排列在由核苷酸和蛋白質組成的染色體（右圖）上。每一個基因所佔據的位置稱為基因座。

在大部份生物體內，每個細胞都具有兩套染色體，每對染色體的兩個成員分別來自父本和母本，稱為同源染色體。同源染色體含有大致相同的基因序列，但基因的內容 — 核苷酸的序列 — 則可能不一樣。同一個基因的不同核苷酸序列版本，就是不同的等位基因。

若個體在同一個基因座的 2 個等位基因（分別位於兩條同源染色體）的核苷酸序列是相同的，這基因座的遺傳性狀便稱為純合；若 2 個等位基因的核苷酸序列並不相同，這基因座的遺傳性狀便稱為雜合。

生殖細胞藉減數細胞分裂製造配子，把兩套同源染色體分別注入不同的配子中，令配子在每一個基因座只擁有一套等位基因。雌雄配子經受精結合後，子代的等位基因又恢復成一對。